多肽纯化中的常见15个问题与解答，妥妥的干货

1、检测肽纯度的一般方法是什么？

它通常由高效液相色谱法（HPLC）测定。

2、肽含量和肽纯度有什么区别？

肽不仅包含正确的肽，还包含杂质，例如生产中的水和有机盐。肽纯度是指相对于所有杂质（水分除外）正确肽的数量。然而，肽含量是目标肽相对于样品中其他所有物质的百分比，通常由 N 元素分析和氨基酸分析确定。因此，即使肽纯度达到99%，考虑到水和有机盐，含量仍可能为70%-80%。

3、肽分离纯化最常用的技术是什么？

最常见的技术是反相高效液相色谱 (RP-HPLC)。

4、RP-HPLC 中通常使用哪种流动相进行肽分离和纯化？

最常见的流动相是水和乙腈，三氟乙酸充当离子对试剂。根据不同的肽段，采用合适的梯度洗脱进行分离。

5、为什么在流动相中添加 TFA 作为离子对试剂？是否有任何其他流动相或离子对试剂可用于肽分离和纯化？

TFA可用于调节流动相的pH值，作为离子对试剂与多肽相互作用，增强分离效果，显着改善峰形。

其他用于多肽分离纯化的流动相或离子对试剂包括乙酸体系、磷酸体系、盐酸体系、七氟丁酸等，可通过调节pH达到很好的分离效果。

6、如何溶解多肽？

大多数肽可以溶解在超纯水中。对于一些不溶性肽，需要先分析氨基酸序列。酸性肽可先溶于少量碱性溶液（如0.1%氨水），然后稀释至所需浓度。作为碱性肽，可溶于少量酸性溶液（如乙酸、三氟乙酸），然后稀释至所需浓度。对于疏水肽，可溶于强极性有机溶剂，如DMF、甲醇、丙醇、异丙醇、DMSO等。

7、RP-HPLC中常用的色谱填料有哪些？

最常见的填料是 C18、C8 和 C4 反相色谱柱。

8、纯化中如何选择色谱填料？

不同序列的肽在理化特性和疏水性方面表现出很大差异。在大多数情况下，C18 色谱柱对分子量小于 4000 或亲水性的肽段的分离效果最好。C4 柱适用于分子量超过 5000 或疏水末端。C8列介于C18和C4之间，其效果更类似于C18。对于一些特殊的选择性肽段，也可以选择苯基柱和聚合物柱。

9、纯化中选择聚合物填料的原则是什么？

当需要更高的 pH 或温度时，具有宽 pH 范围的聚合物 HPLC 柱可能适用于纯化。它们在极端pH条件下不会降解，因此可以使用强酸和强碱作为流动相进行分离和纯化。

10、什么会影响多肽纯化的结果？

影响因素很多，主要包括流动相、色谱柱类型、柱温、波长、色谱仪性能等。这些差异可能会导致最终结果出现错误。

11、频繁的基线漂移可能是什么原因？如何解决？

反相分离中基线漂移的主要原因是固定 TFA 浓度的梯度洗脱会导致 210-220 nm 处的吸收基线发生偏移。建议使检测波长尽可能接近215 nm，以减少或消除TFA吸收光谱变化对基线漂移的影响。此外，与溶剂 B 相比，溶剂 A 中添加的 TFA 减少 15% 可以补偿基线漂移。例如，如果溶剂 A 中的 TFA 浓度为 0.1%，则建议溶剂 B 中添加 0.085%

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12、反相色谱纯化后，如何从最终产品中去除流动相中的TFA、乙腈等杂质？

只要不超过耐受范围，冻干可能是去除大部分 TFA 和乙腈的最简单和最有效的方法。但该方法不能满足一些对TFA含量要求较高的多肽类药物的要求。应与它们进行特殊的盐转化和脱盐。

13、肽的一般盐形式有哪些？如何转换盐形式或脱盐？

大多数肽在TFA系统下纯化，因此TFA盐是最常见的形式，其次是乙酸盐和盐酸盐形式，很少有肽药物是特殊盐形式。离子交换和 HPLC 是最常用的盐转化方法，而 G25（GE Healthcare 的葡聚糖凝胶）柱可用于脱盐。

14、TFA 是否仅用于调节缓冲液中的 pH 值？TFA 浓度越高，基线漂移越严重。这是否意味着如果缓冲液的 pH 值允许，TFA 的浓度越低越好？

TFA可以作为离子对，浓度通常在0.05-0.1%左右。浓度过高会使溶液过酸，影响色谱柱的使用时间。

同时，TFA 可以抑制硅胶表面的硅烷醇基团，改善碱性化合物的峰形。如果使用 0.1% TFA 有时分离效果不好，可以尝试 0.2% TFA，但使用后需要立即冲洗色谱柱。

在梯度洗脱时，由于基线漂移，它对制备的影响很小。

15、为什么肽样品需要在上样柱前进行预处理？有哪些制备方法？

制备柱更容易被污染，因为与分析柱相比，它们处理的样品更多。因此，需要对样品进行预处理以延长色谱柱的使用时间。主要有五种方法：过滤、离心、柱前过滤和在线过滤。